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目標，材料及方法

本研究有兩大目標，首先是建立世界最大的葛瑞夫茲氏病家族庫，這當然也就是到目前為止唯一的華人資料庫；第二是根據此一家族庫來進行連鎖分析（本階段針對CTLA4基因座區域內的三個相當靠近的微衛星基因標識（microsatellite markers）進行檢測。之所以先選擇CTLA4區域，一方面是因為此基因座是經過以上種種研究方式，有不少研究團隊仍認為是可能基因，另一方面的原因則是此區域內的三個基因CD28、CTLA4、及ICOS（inducible T-cell co-stimulator），都與免疫系統有關，是合理的候選基因（candidate gene）。本計畫在開始前就已通過台大醫院倫理委員會之審查。

就方法而言，我們採取典型的基因研究之程序，包括定義疾病之表現型、確認病例、收集家族、收集DNA檢體、處理DNA檢體、基因定型（genotyping）、以及資料分析。每個個案，都由內分泌科的醫師進行訪談與檢查，而不假手於護士或研究助理。符合以下四個診斷準則至少兩項者，定義為葛瑞夫茲氏病患者，這四個準則分別為：一、確定的甲狀腺機能亢進，二、瀰漫性甲狀腺腫，三、甲狀腺眼病變或是脛前黏液水腫，以及四、甲促素受器抗體。個案填具同意書之後，我們進行問卷以及血液檢體之收集。就家族型態而言，我們最優先收集染病同胞對，此外，也收集親子三元體。DNA的萃取是利用市售的基因抽取組（PureGene®, Gentra system）。本研究檢証的三個微衛星基因標識，分別位於CD28的3’UTR（untranslated region）、CTLA4的3’UTR、以及ICOS的第四intron，其PCR之引子，是根據其他研究團隊先前所使用的引子。我們在ABI®9600 PCR平台上，利用AccuPrime® Taq polymerase對這三組同時進行多重PCR。基因定型在ABI®3100自動定序儀上操作，其結果則由3.7版的GENOTYPER®讀取。

就病人來源上，首被鑑取者（proband）是在台大醫院及一個合作門診中心（遠東聯合門診）收集，然後我們再擴及需要納入之家屬，這些人的居住地就分佈在在全國各地。就人種上而言，包括了閩南人（75.3%）、客家人（15.7%）、最近五十年前後才從大陸遷台人士及後代（8.2%）、及原住民（0.8%），但分析時，暫時未納入原住民，因為就人種上而言，原住民明顯有別於前三者代表之漢民族。

結果及結論

本研究自民國九十年八月一日起，至九十一年五月一日為止，在九個月的時間內，總計收錄153個家族內的593位個案（包含染病個體及需納入之家屬）。家族以及個案的收集，仍持續進行，然而對於碩士論文階段，暫以此為一段落進行分析。在所有家族中，家族譜完整已可供分析者共計114個家族。扣除帶有蒙古、賽夏、以及平埔族血統的4個家族後，實際納入分析比對者為110個家族，共472人。由於統計軟體分析時之需要，有時必須在家族內將已過世或是無法取得檢體的親屬設為『虛設』的（dummy）個案，此時總家族數仍為110個家族，而總人數變為536人。針對實際有檢體的472人來分析，男性佔159人（33.7%），女性佔313人（66.3%）。染病個體總計268人，其中57人（21.3%）為男性，211人（78.7%）為女性。平均發病年齡男性為34歲，女性則為28歲。

我們的家族，如果要拆解成染病同胞對（affected sib-pair，簡稱ASP）的形式作連鎖分析，共有116組『所有可能染病同胞對』（all possible ASPs），或是92組『獨立染病同胞對』（independent ASPs），而若要以親子三元體（trios）的形式作相關研究，則可以有224組。比較其他各國團隊，他們最多大約只收集到70對獨立染病同胞對，或是129組親子三元體。所以，我們確認已經建立了世界最大，也是華人唯一，的葛瑞夫茲氏病之家族性檢體庫，而且這個家族檢體庫還在持續穩定擴充中。

我們接著針對CTLA4附近這三個微衛星基因標識進行基因定型。我們的結果顯示，CTLA4 3’UTR微衛星標識是一個蠻好的標識，它的基因多型性訊息程度（polymorphism information content, PIC）可達0.759。就我們的家族庫而言，CTLA4 3’UTR之單點訊息程度（single point information content）為0.6698，比另外兩個微衛星標識（CD28為0.1572，而 ICOS為0.3717）明顯要來得好。至於多點訊息程度，則在這整個區域都可以達到0.78以上，算是相當不錯。

我們以MLINK及ILINK等軟體，進行有母數連鎖分析，然而所得到之lod score值均小於零。至於無母數連鎖分析，則是利用SAGE及GENEHUNTER等軟體操作。SIBPAL of SAGE顯示在CTLA4 3’UTR標識處，的確在染病同胞間，會較可能遺傳到相同的對偶基因型（allele sharing proportion in affected sibs = 0.5252，相對於虛無假設的 allele sharing proportion = 0.5），此時 P = 0.198。而GENEHUNTER也算出最大的單點NPL score出現在CTLA4 3’UTR標識，其值為1.19 (P = 0.095)，而多點 NPL score之最大值出現在CD28 3’UTR標識，為1.28 (P = 0.079)。

整體而言，這樣的結果（較高的相同對偶基因比例，大於1.0的NPL score），就純粹統計上而言，尚未達到統計有意義之地步，然而卻仍然代表著在這個CD28-CTLA4-ICOS區域有可能存在著本疾病的易罹病基因。倘若此區域存在著中等效果之基因的話，就恰好是連鎖分析的弱點，而可能達不到統計學上的意義。近期內我們將繼續對此區域進行較為敏銳之家族檢體相關研究，如TDT，來驗證以上的可能性。更後續的研究中，我們會利用這個珍貴的家族庫，繼續找尋其他可能基因，甚至進行基因全體逐點搜尋。